ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG Y HỌC

PHẦN I. TRẮC NGHIỆM NHIỀU PHƯƠNG ÁN LỰA CHỌN (100 câu)

Thí sinh chọn một phương án đúng nhất trong mỗi câu hỏi sau:

Câu 1. Mục tiêu cơ bản của kỹ thuật tách chiết DNA trong sinh học phân tử là gì?

Câu 2. Quy trình tách chiết DNA kinh điển bao gồm bao nhiêu bước cơ bản?

Câu 3. Trong kỹ thuật tách chiết DNA, hóa chất SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) có vai trò chính là gì?

Câu 4. Enzyme nào thường được sử dụng trong giai đoạn phá hủy màng tế bào để loại bỏ các protein liên kết với DNA (như histone)?

Câu 5. Quan sát sơ đồ quy trình tách chiết DNA sau:

Hỗn hợp hóa chất nào được sử dụng phổ biến để biến tính, kết tủa và tách loại protein ra khỏi dung dịch DNA?

Câu 6. Sau khi bổ sung Phenol - Chloroform và tiến hành ly tâm, phân tử DNA nằm ở pha nào trong ống nghiệm?

Câu 7. Hóa chất nào được dùng để kết tủa DNA ra khỏi dung dịch nước chứa nucleic acid?

Câu 8. Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) sử dụng ở bước cuối cùng của tách chiết DNA có vai trò gì?

Câu 9. Trong dung dịch đệm TE, ion hóa trị hai nào cần thiết cho hoạt tính của DNase bị EDTA bất hoạt nhờ cơ chế tạo phức chelate?

Câu 10. Để định lượng nồng độ và đánh giá độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid thu được, người ta sử dụng thiết bị nào?

Câu 11. Giá trị độ hấp thụ quang (OD) cực đại của nucleic acid nằm ở bước sóng nào?

Câu 12. Protein trong mẫu dịch chiết hấp thụ ánh sáng tử ngoại cực đại ở bước sóng nào do sự có mặt của các amino acid có vòng thơm?

Câu 13. Một đơn vị $1\text{ OD}_{260}$ tương đương với nồng độ bao nhiêu đối với phân tử DNA mạch đôi?

Câu 14. Một đơn vị $1\text{ OD}_{260}$ quy đổi ra nồng độ tương đương đối với RNA hoặc DNA mạch đơn là bao nhiêu?

Câu 15. Dung dịch DNA được coi là tinh sạch, đạt chuẩn dùng cho các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo khi có tỉ số $\text{OD}_{260}/\text{OD}_{280}$ nằm trong khoảng nào?

Câu 16. Nếu mẫu DNA sau tách chiết có tỉ số $\text{OD}_{260}/\text{OD}_{280} < 1{,}6$, hiện tượng này phản ánh điều gì?

Câu 17. Nguyên lý cơ bản phân tách các phân tử acid nucleic trong kỹ thuật điện di là dựa vào:

Câu 18. Điện tích âm của phân tử DNA và RNA trong môi trường đệm điện di là do thành phần nào quyết định?

Câu 19. Trong quá trình điện di, hai yếu tố chính chi phối tốc độ di chuyển của phân tử nucleic acid là:

Câu 20. Môi trường thạch (gel) dùng trong điện di acid nucleic thường được pha chế từ:

Câu 21. Bản gel điện di đóng vai trò như một hệ thống:

Câu 22. Mối quan hệ giữa kích thước phân tử DNA và tốc độ di chuyển trong bản gel điện di là gì?

Câu 23. Quan sát hình ảnh nạp mẫu và nguyên lý điện di sau:

Khi nạp mẫu DNA vào các giếng gel, các giếng này bắt buộc phải nằm gần điện cực nào của bộ nguồn?

Câu 24. Nồng độ gel agarose thường được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm để tách các đoạn DNA kích thước thông thường là:

Câu 25. Loại dung dịch đệm chạy điện di DNA nào sau đây được sử dụng phổ biến nhất?

Câu 26. Trong mẫu nạp điện di, chất chỉ thị màu (Loading dye) có chức năng gì?

Câu 27. Hóa chất nhuộm DNA kinh điển gắn xen (intercalate) giữa các cặp base của chuỗi xoắn kép DNA là:

Câu 28. Phức hợp DNA - Ethidium bromide sẽ phát huỳnh quang màu đỏ cam khi được kích thích bởi loại bức xạ nào?

Câu 29. Nhược điểm lớn nhất và nguy cơ an toàn sinh học của Ethidium bromide (EtBr) là gì?

Câu 30. Thuốc nhuộm nào sau đây là chất nhuộm DNA huỳnh quang thế hệ mới, an toàn hơn và có thể thay thế EtBr?

Câu 31. Quan sát hình ảnh bản gel sau khi chụp ảnh dưới tia cực tím:

Khái niệm "Thang DNA chuẩn" (DNA Ladder / Marker) mang ý nghĩa gì?

Câu 32. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được định nghĩa là phương pháp:

Câu 33. Cơ chế phân tử của phản ứng PCR mô phỏng theo quá trình sinh học tự nhiên nào trong tế bào?

Câu 34. Thành phần nào sau đây không thuộc hỗn hợp phản ứng PCR cơ bản?

Câu 35. Trong phản ứng PCR, cơ chất cung cấp năng lượng và các viên gạch nucleotide xây dựng nên mạch DNA mới là:

Câu 36. Ion kim loại hóa trị hai nào là cofactor thiết yếu bắt buộc phải có trong dung dịch đệm để enzyme Taq DNA polymerase hoạt động?

Câu 37. Mồi (primer) được sử dụng trong kỹ thuật PCR chuẩn có bản chất hóa học là gì?

Câu 38. Độ dài thông thường của các đoạn mồi PCR được tổng hợp hóa học là khoảng bao nhiêu?

Câu 39. Đại lượng $T_m$ của đoạn mồi trong phản ứng PCR là viết tắt của thuật ngữ nào và có ý nghĩa gì?

Câu 40. Enzyme Taq DNA polymerase sử dụng phổ biến trong PCR được tinh chế từ loài vi sinh vật nào?

Câu 41. Enzyme Taq polymerase hoạt động kéo dài mạch DNA theo chiều nào?

Câu 42. Nhiệt độ hoạt động tối ưu nhất của enzyme Taq DNA polymerase nằm trong khoảng nào?

Câu 43. Hạn chế lớn nhất của enzyme Taq DNA polymerase tự nhiên trong nghiên cứu phân tử là gì?

Câu 44. Loại DNA polymerase nào sau đây có hoạt tính sửa sai cao (proofreading activity) nhờ sở hữu hoạt tính $3' \to 5'$ exonuclease?

Câu 45. Một chu kỳ nhiệt chuẩn trong phản ứng PCR gồm bao nhiêu giai đoạn kế tiếp nhau?

Câu 46. Quan sát sơ đồ chu kỳ nhiệt sau:

Thứ tự chuẩn xác của các giai đoạn trong một chu kỳ nhiệt PCR là:

Câu 47. Trong chu kỳ PCR, bước biến tính tách hai mạch đơn DNA thường được cài đặt ở nhiệt độ nào?

Câu 48. Giai đoạn gắn mồi (Annealing) trong chu kỳ PCR thường được tiến hành trong khoảng nhiệt độ nào?

Câu 49. Giai đoạn kéo dài tổng hợp mạch mới (Extension) của chu kỳ PCR sử dụng Taq polymerase được cài đặt tối ưu ở nhiệt độ:

Câu 50. Quan sát sơ đồ diễn biến sản phẩm qua các chu kỳ PCR:

Bắt đầu từ chu kỳ nhiệt thứ mấy thì sản phẩm DNA mục tiêu có chiều dài chính xác (giới hạn bởi 2 đầu mồi) mới xuất hiện lần đầu tiên?

Câu 51. Sau chu kỳ PCR thứ ba hoàn tất, từ 1 phân tử DNA sợi đôi ban đầu sẽ tạo ra bao nhiêu phân tử DNA sợi đôi có độ dài chuẩn tuyệt đối của đoạn mục tiêu?

Câu 52. Tổng số phân tử DNA kép được tạo ra sau $n$ chu kỳ PCR lý thuyết từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu được tính bằng công thức nào?

Câu 53. Một quy trình PCR thông thường trong phòng xét nghiệm di truyền thường được thiết lập chạy khoảng bao nhiêu chu kỳ?

Câu 54. Ứng dụng nào sau đây không phải là ứng dụng trực tiếp của phản ứng PCR?

Câu 55. Phương pháp giải trình tự DNA theo phương pháp hóa học kết thúc chuỗi (chain termination method) do nhà khoa học nào phát minh?

Câu 56. Điểm khác biệt mấu chốt về thành phần mồi giữa giải trình tự Sanger cổ điển và phản ứng PCR thông thường là:

Câu 57. Thành phần đặc biệt làm ngưng kết thúc quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotide trong phản ứng giải trình tự Sanger là:

Câu 58. Quan sát cấu trúc hóa học của phân tử ddNTP:

Điểm khác biệt cấu tạo giữa ddNTP và dNTP khiến ddNTP làm ngừng phản ứng kéo dài mạch là gì?

Câu 59. Tại sao khi thiếu nhóm $3'-\ce{OH}$ trên phân tử đường thì chuỗi polynucleotide không thể kéo dài tiếp tục?

Câu 60. Trong phương pháp giải trình tự Sanger kinh điển, người ta phải chuẩn bị đồng thời bao nhiêu ống nghiệm phản ứng song song cho một mẫu DNA?

Câu 61. Trong 4 ống nghiệm của phương pháp Sanger kinh điển, thành phần nào sau đây có mặt ở cả 4 ống?

Câu 62. Mỗi ống trong 4 ống nghiệm của phản ứng Sanger kinh điển được bổ sung thêm một lượng nhỏ của:

Câu 63. Tỉ lệ nồng độ giữa ddNTP so với dNTP trong phản ứng Sanger phải như thế nào để đảm bảo đọc được toàn bộ chiều dài đoạn DNA?

Câu 64. Đoạn enzyme Klenow của DNA polymerase I được sử dụng trong giải trình tự Sanger cổ điển có đặc điểm gì?

Câu 65. Để phân tách các đoạn sản phẩm kết thúc chuỗi có kích thước chênh lệch nhau chỉ 1 nucleotide trong phương pháp Sanger, người ta chạy điện di trên:

Câu 66. Khi đọc trình tự DNA trên bản gel điện di phóng xạ của phương pháp Sanger kinh điển (từ 4 giếng A, C, G, T), nguyên tắc đọc là:

Câu 67. Trình tự đọc được trực tiếp từ đáy lên đỉnh của bản gel Sanger tương ứng với chiều nào của chuỗi DNA mới được tổng hợp?

Câu 68. Trong phương pháp giải trình tự tự động (Automated DNA sequencing), chất đánh dấu được sử dụng là:

Câu 69. Điểm cải tiến mang tính đột phá của kỹ thuật giải trình tự tự động so với Sanger kinh điển là:

Câu 70. Quan sát sơ đồ giải trình tự tự động sử dụng 4 loại ddNTP huỳnh quang:

Trong phản ứng này, 4 loại ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được phân biệt với nhau nhờ đặc điểm nào?

Câu 71. Trong máy giải trình tự tự động, hệ thống mao quản chứa gel polymer siêu mịn có ưu điểm gì so với bản gel tấm polyacrylamide truyền thống?

Câu 72. Bộ phận cảm biến (detector) kết hợp tia laser trong máy giải trình tự tự động có chức năng gì?

Câu 73. Quan sát đồ thị tín hiệu giải trình tự tự động (Electropherogram):

Tín hiệu trình tự DNA được máy tính phân tích và thể hiện dưới dạng nào?

Câu 74. Khi quan sát sắc ký đồ giải trình tự DNA tự động của một bệnh nhân, tại một vị trí nucleotide duy nhất xuất hiện hai đỉnh sóng có chiều cao tương đương nhau đè lên nhau (ví dụ một đỉnh xanh của C và một đỉnh đỏ của T). Điều này chứng minh:

Câu 75. Kỹ thuật FISH là từ viết tắt của thuật ngữ khoa học tiếng Anh nào?

Câu 76. Ý nghĩa của cụm từ "In Situ" trong tên gọi của kỹ thuật FISH là gì?

Câu 77. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật FISH là dựa trên:

Câu 78. Đoạn mẫu dò (probe) sử dụng trong kỹ thuật FISH được đánh dấu bằng:

Câu 79. Bước đầu tiên trong quy trình thực nghiệm kỹ thuật FISH là:

Câu 80. Hóa chất nào thường được bổ sung vào dung dịch lai để hạ thấp nhiệt độ nóng chảy của DNA, bảo vệ hình thái nhiễm sắc thể không bị phá hủy trong bước biến tính của FISH?

Câu 81. Mục đích quan trọng của bước "Làm sạch (Rửa tiêu bản)" sau khi tiến hành phản ứng lai trong FISH là gì?

Câu 82. Để quan sát và phân tích kết quả của kỹ thuật lai FISH, thiết bị bắt buộc phải có là:

Câu 83. Kỹ thuật Metaphase FISH (lai trên nhiễm sắc thể kỳ giữa) được coi là "tiêu chuẩn vàng" nhờ ưu điểm nổi bật nào?

Câu 84. Nhược điểm chính của kỹ thuật Metaphase FISH là gì?

Câu 85. Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật Interphase FISH (lai trên nhân tế bào ở kỳ trung gian) là:

Câu 86. Kỹ thuật Interphase FISH thường được ứng dụng hàng đầu trong trường hợp lâm sàng nào cần kết quả khẩn cấp?

Câu 87. Quan sát kết quả FISH chẩn đoán tế bào học sau:

Biết probe xanh gắn đặc hiệu NST 13, probe đỏ gắn đặc hiệu NST 21. Hình ảnh tế bào có 2 tín hiệu xanh và 2 tín hiệu đỏ cho phép kết luận:

Câu 88. Quan sát kết quả xét nghiệm FISH sau:

Biết probe xanh đặc hiệu cho NST 13, probe đỏ đặc hiệu cho NST 21. Tiêu bản hiển thị 2 tín hiệu xanh và 3 tín hiệu đỏ trong nhân tế bào. Bệnh nhân này được chẩn đoán mắc:

Câu 89. Nhóm bất thường số lượng nhiễm sắc thể nào sau đây thường được chỉ định chẩn đoán nhanh trước sinh bằng bộ probe đa màu FISH?

Câu 90. Khi kỹ thuật lập bộ nhiễm sắc thể kinh điển (Karyotyping) không phát hiện được bất thường do kích thước đoạn đột biến quá nhỏ ($< 3 - 5\text{ Mb}$), kỹ thuật nào có thể phát hiện được?

Câu 91. Trong ung thư học, kỹ thuật FISH đóng vai trò quan trọng trong việc:

Câu 92. Sự khác biệt cơ bản nhất về mục đích ứng dụng giữa kỹ thuật PCR và giải trình tự DNA là gì?

Câu 93. Sự giống nhau cơ bản giữa phản ứng PCR và phản ứng giải trình tự Sanger là:

Câu 94. Kỹ thuật nào sau đây cho phép phát hiện trực tiếp đột biến mất đoạn vi mô (microdeletion) trên nhiễm sắc thể mà không cần phải giải mã toàn bộ trình tự nucleotide?

Câu 95. Trong điện di gel agarose, dung dịch đệm TBE chứa Tris, EDTA và chất nào sau đây?

Câu 96. Yếu tố nào sau đây quyết định tính đặc hiệu (chỉ nhân bản đúng trình tự đích) của một phản ứng PCR?

Câu 97. Nếu trong phản ứng PCR, nhiệt độ gắn mồi (Annealing) được cài đặt quá thấp so với nhiệt độ $T_m$ của mồi, hiện tượng gì sẽ xảy ra?

Câu 98. Nếu nhiệt độ gắn mồi trong PCR được cài đặt quá cao vượt xa nhiệt độ $T_m$ của cặp mồi, hậu quả là gì?

Câu 99. Phương pháp nào sau đây được coi là tiêu chuẩn tham chiếu cao nhất ("tiêu chuẩn vàng") để khẳng định một đột biến điểm mới phát hiện trên gen?

Câu 100. Trong quy trình FISH, nếu bước rửa loại bỏ probe dư thừa được thực hiện với độ nghiêm ngặt (stringency) quá thấp (nhiệt độ rửa quá thấp hoặc nồng độ muối quá cao), kết quả quan sát sẽ ra sao?

PHẦN II. TRẮC NGHIỆM ĐÚNG/SAI (15 câu)

Thí sinh trả lời Đúng hoặc Sai cho mỗi nhận định a), b), c), d) trong các câu hỏi sau:

Câu 1. Xét quy trình tách chiết và đánh giá độ tinh sạch của acid nucleic:
a) SDS là chất tẩy rửa có bản chất hoạt động bề mặt giúp hòa tan lipid màng tế bào và màng nhân.
b) Phenol bão hòa có tác dụng bảo vệ cấu trúc bậc 3 của protein không bị biến tính trong quá trình ly tâm.
c) Dung dịch DNA sau tách chiết có tỉ số $\text{OD}_{260}/\text{OD}_{280} = 1{,}9$ là mẫu đạt tiêu chuẩn tinh sạch tốt.
d) Nếu mẫu nucleic acid có tỉ số $\text{OD}_{260}/\text{OD}_{280} = 2{,}2$, điều này chứng tỏ mẫu đã bị nhiễm bẩn protein với nồng độ cao.

Câu 2. Về nguyên lý và kỹ thuật điện di acid nucleic trên gel agarose:
a) Trong môi trường đệm điện di có pH kiềm nhẹ, DNA mang điện tích âm thuần do các gốc phosphate phân ly.
b) Phân tử DNA có kích thước càng lớn thì tốc độ di chuyển qua các lỗ gel về cực dương càng nhanh.
c) Gel polyacrylamide thường được ưu tiên sử dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thước lớn trên $20\text{ kb}$.
d) Bản gel điện di cần được đặt sao cho các giếng nạp mẫu nằm ở phía cực âm (cathode) của hệ thống điện trường.

Câu 3. Về hóa chất nhuộm DNA và an toàn phòng thí nghiệm:
a) Ethidium bromide (EtBr) xen vào giữa các mặt phẳng của các cặp base nitrogen liền kề trong chuỗi xoắn kép DNA.
b) Phức hợp DNA - EtBr hấp thụ ánh sáng hồng ngoại và phát ánh sáng vàng có bước sóng ngắn.
c) EtBr được xếp vào nhóm hóa chất có nguy cơ gây đột biến gene và có khả năng gây ung thư cho người thao tác.
d) SYBR Safe và GelRed là các thuốc nhuộm huỳnh quang mới được phát triển nhằm tăng độ an toàn sinh học so với EtBr.

Câu 4. Về các thành phần thiết yếu trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR):
a) Taq DNA polymerase là enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus.
b) Phản ứng PCR bắt buộc phải sử dụng cặp mồi có bản chất là các phân tử RNA tự nhiên giống như trong tái bản in vivo.
c) Nồng độ ion $\ce{Mg^2+}$ trong dung dịch đệm ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính xúc tác và tính đặc hiệu của Taq polymerase.
d) Bốn loại dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) là nguồn cung cấp nucleotide chủ yếu để kéo dài chuỗi DNA mới trong PCR.

Câu 5. Về các thông số nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR chuẩn:
a) Giai đoạn biến tính tách hai mạch đơn DNA thường được cài đặt ở nhiệt độ từ $94^\circ\text{C}$ đến $95^\circ\text{C}$.
b) Nhiệt độ giai đoạn gắn mồi (Annealing) luôn luôn phải cài đặt cao hơn nhiệt độ nóng chảy $T_m$ của cặp mồi ít nhất $10^\circ\text{C}$.
c) Nhiệt độ kéo dài tổng hợp mạch mới tối ưu của Taq DNA polymerase là $72^\circ\text{C}$.
d) Thời gian của giai đoạn kéo dài mạch thường được tính toán dựa trên độ dài của đoạn DNA khuếch đại (khoảng 1 phút cho mỗi 1000 bp).

Câu 6. Về động học khuếch đại và sản phẩm của phản ứng PCR:
a) Sau chu kỳ nhiệt đầu tiên của phản ứng PCR, các đoạn DNA mục tiêu có độ dài chính xác đã bắt đầu chiếm ưu thế tuyệt đối.
b) Ở chu kỳ nhiệt thứ ba, sản phẩm DNA sợi đôi có chiều dài chuẩn giới hạn bởi hai đầu mồi mới xuất hiện lần đầu tiên.
c) Từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu, sau 30 chu kỳ PCR lý thuyết, số lượng bản sao tạo thành đạt xấp xỉ $2^{30}$ phân tử.
d) Hiệu suất khuếch đại của phản ứng PCR trong thực tế luôn duy trì ở mức tối đa $100\%$ kể cả ở các chu kỳ cuối cùng từ 35 đến 40.

Câu 7. Về đặc tính của các enzyme polymerase được sử dụng trong khuếch đại DNA:
a) Taq DNA polymerase sở hữu hoạt tính $3' \to 5'$ exonuclease giúp loại bỏ các nucleotide lắp ráp sai trong quá trình sao chép.
b) Tỉ lệ bắt cặp sai nucleotide của enzyme Taq polymerase cao hơn so với enzyme Pfu DNA polymerase.
c) Pfu DNA polymerase được tinh chế từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Pyrococcus furiosus có khả năng tự sửa sai chính xác cao.
d) Đoạn Klenow là phần cấu trúc enzyme thu được khi cắt bỏ hoạt tính $5' \to 3'$ exonuclease của DNA polymerase I từ vi khuẩn E. coli.

Câu 8. Về nguyên tắc giải trình tự DNA theo phương pháp kết thúc chuỗi của Frederick Sanger:
a) Phương pháp Sanger sử dụng đồng thời 2 đoạn mồi xuôi và mồi ngược trong cùng một ống phản ứng giống hệt như PCR.
b) Phân tử ddNTP thiếu nhóm hydroxyl ($-\ce{OH}$) ở vị trí carbon số $3'$ của vòng đường pentose.
c) Khi một phân tử ddNTP được gắn ngẫu nhiên vào chuỗi đang tổng hợp, chuỗi polynucleotide sẽ lập tức bị chặn lại và không thể nối dài thêm.
d) Tỉ lệ nồng độ của ddNTP trong ống phản ứng luôn được duy trì cao gấp hàng trăm lần so với dNTP tương ứng.

Câu 9. Về giải trình tự Sanger cổ điển trên 4 ống nghiệm và điện di phóng xạ:
a) Bốn ống nghiệm phản ứng chứa 4 loại ddNTP riêng biệt được đánh số là ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP.
b) Bản gel polyacrylamide phân tách sản phẩm Sanger có khả năng phân biệt hai đoạn DNA chênh lệch nhau chỉ 1 nucleotide.
c) Để đọc trình tự của chuỗi DNA mới tổng hợp, người ta đọc thứ tự các vạch phóng xạ từ đỉnh gel (cực âm) xuống đáy gel (cực dương).
d) Trình tự đọc được từ đáy bản gel lên trên biểu thị chiều từ đầu $5'$ đến đầu $3'$ của mạch DNA mới được tổng hợp.

Câu 10. Về kỹ thuật giải trình tự DNA tự động bằng điện di mao quản:
a) Bốn loại ddNTP được gắn với 4 chất phát huỳnh quang có bước sóng phát xạ màu sắc khác biệt nhau.
b) Toàn bộ phản ứng giải trình tự tự động có thể thực hiện chung trong một ống nghiệm duy nhất thay vì chia làm 4 ống.
c) Máy giải trình tự sử dụng chùm tia laser kích thích huỳnh quang và đầu thu quang học để ghi lại tín hiệu dưới dạng các đỉnh sóng (peaks).
d) Đỉnh sóng màu xanh lục trên sắc ký đồ giải trình tự tự động chuẩn luôn đại diện cho nucleotide loại Thymine (T).

Câu 11. Về nguyên lý và quy trình của kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH):
a) FISH cho phép phát hiện sự có mặt và định vị chính xác vị trí của đoạn trình tự DNA mục tiêu ngay trên tiêu bản tế bào.
b) Mẫu dò (probe) là đoạn acid nucleic mạch đơn hoặc kép được đánh dấu bằng các phân tử phát huỳnh quang.
c) Formamide được sử dụng trong dung dịch lai nhằm mục đích làm tăng nhiệt độ biến tính của phân tử DNA lên trên $100^\circ\text{C}$.
d) Bước rửa sau lai có vai trò tối quan trọng giúp loại bỏ các phân tử probe không liên kết hoặc liên kết lỏng lẻo không đặc hiệu.

Câu 12. So sánh kỹ thuật Metaphase FISH và Interphase FISH:
a) Metaphase FISH sử dụng tế bào ở kỳ giữa khi các nhiễm sắc thể đã đóng xoắn cực đại và biểu hiện hình thái rõ nét.
b) Interphase FISH bắt buộc phải trải qua quá trình nuôi cấy tế bào dài ngày để kích thích tế bào đi vào phân chia nguyên phân.
c) Metaphase FISH là "tiêu chuẩn vàng" để xác định vị trí chính xác của đoạn tín hiệu trên các nhánh của nhiễm sắc thể.
d) Interphase FISH đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán tiền sinh khẩn cấp và sàng lọc nhanh các lệch bội số lượng nhiễm sắc thể.

Câu 13. Phân tích kết quả tế bào học bằng kỹ thuật FISH:
a) Trong một tế bào sinh dưỡng người bình thường ở kỳ trung gian, probe đặc hiệu cho NST 21 sẽ cho 2 chấm tín hiệu huỳnh quang riêng biệt.
b) Nếu tế bào hiển thị 3 tín hiệu huỳnh quang của probe đặc hiệu NST 21, cá thể đó được chẩn đoán mắc hội chứng Down thể ba nhiễm.
c) Probe kép đánh dấu NST 13 (xanh) và NST 21 (đỏ) hiển thị 3 chấm xanh và 2 chấm đỏ chứng tỏ thai nhi bị hội chứng Down.
d) Kỹ thuật FISH chỉ có khả năng phát hiện các đột biến mất đoạn lớn trên $10\text{ Mb}$ mà không thể phát hiện các vi mất đoạn nhỏ.

Câu 14. Về ứng dụng lâm sàng và y học của các kỹ thuật sinh học phân tử:
a) Kỹ thuật PCR kết hợp với giải trình tự gen có thể giúp xác định chính xác các đột biến kháng thuốc ở vi khuẩn lao hoặc virus HIV.
b) Kỹ thuật FISH có thể phát hiện gen dung hợp BCR-ABL hình thành do chuyển đoạn tương hỗ giữa NST 9 và NST 22 trong bệnh bạch cầu kinh dòng tủy (CML).
c) Đo quang phổ mật độ quang $\text{OD}_{260}$ có thể phân biệt chính xác một mẫu DNA người bình thường và một mẫu DNA mang đột biến điểm.
d) Điện di gel agarose thông thường là phương pháp đủ độ phân giải để phát hiện đột biến thay thế một cặp nucleotide đơn lẻ (SNP).

Câu 15. Về các yếu tố kỹ thuật và kiểm soát sai sót trong phòng xét nghiệm phân tử:
a) Việc nạp mẫu DNA vào giếng gel quá đầy có thể làm mẫu tràn sang các giếng lân cận gây ra hiện tượng dương tính giả.
b) Hiện tượng "mồi dimer" (primer-dimer) trong PCR là do các phân tử mồi tự bắt cặp bổ sung với nhau ở đầu $3'$ và bị khuếch đại.
c) Đọc kết quả giải trình tự tự động tại vùng quá gần đầu $5'$ của mồi ($< 30$ bp) thường có độ chính xác rất cao và đỉnh sóng rất rõ ràng.
d) Nhiệt độ ủ lai trong kỹ thuật FISH càng cao thì độ nghiêm ngặt (stringency) càng tăng, giúp giảm thiểu hiện tượng probe gắn sai vị trí.

PHẦN III. TRẮC NGHIỆM TRẢ LỜI NGẮN (15 câu)

Thí sinh giải bài toán/xác định dữ kiện và điền kết quả ngắn gọn vào vị trí yêu cầu:

Câu 1. Đo mật độ quang một dung dịch DNA kép tinh sạch tại bước sóng 260 nm trên cuvette có độ dày thành 1 cm thu được giá trị $\text{OD}_{260} = 0{,}65$. Nồng độ của phân tử DNA trong dung dịch này bằng bao nhiêu $\mu\text{g/ml}$?

Câu 2. Một mẫu dịch chiết acid nucleic được đo quang phổ thu được độ hấp thụ $\text{OD}_{260} = 0{,}90$ và $\text{OD}_{280} = 0{,}45$. Tính tỉ số $\text{OD}_{260}/\text{OD}_{280}$ của mẫu dịch chiết này.

Câu 3. Nếu bắt đầu phản ứng PCR với đúng 1 phân tử DNA khuôn mẫu sợi đôi ban đầu, giả sử hiệu suất mỗi chu kỳ đạt $100\%$, hỏi sau khi hoàn thành chu kỳ thứ 5 sẽ có tổng cộng bao nhiêu phân tử DNA sợi đôi được tạo ra?

Câu 4. Trong phản ứng PCR khuếch đại từ 1 phân tử DNA khuôn đôi ban đầu, bắt đầu từ chu kỳ nhiệt thứ mấy thì sản phẩm DNA mục tiêu có độ dài chính xác (đúng chiều dài giới hạn bởi 2 đầu mồi) bắt đầu xuất hiện?

Câu 5. Sau 4 chu kỳ PCR từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu, có bao nhiêu phân tử DNA sợi đôi tạo thành có độ dài chuẩn tuyệt đối của đoạn mục tiêu?

Câu 6. Một đoạn mồi PCR có chiều dài gồm 20 nucleotide, trong đó có chứa 6 phân tử Adenine (A), 4 phân tử Thymine (T), 5 phân tử Guanine (G) và 5 phân tử Cytosine (C). Theo công thức kinh nghiệm thô Wallace ($T_m = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$), nhiệt độ nóng chảy $T_m$ của đoạn mồi này là bao nhiêu độ C ($^\circ\text{C}$)?

Câu 7. Nhiệt độ kéo dài mạch tổng hợp (Extension) tối ưu của enzyme Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR thường được cài đặt cố định là bao nhiêu độ C ($^\circ\text{C}$)?

Câu 8. Quan sát kết quả điện di giải trình tự Sanger cổ điển từ 4 giếng (A, C, G, T) theo thứ tự các vạch từ đáy gel chạy lên trên đỉnh gel như sau: vạch 1 (ở đáy nhất) thuộc làn A; vạch 2 thuộc làn T; vạch 3 thuộc làn G; vạch 4 thuộc làn G; vạch 5 thuộc làn C. Hãy viết trình tự đoạn oligonucleotide 5 nucleotide mới được tổng hợp này theo chiều từ $5' \to 3'$.

Câu 9. Để giải mã một đoạn trình tự DNA theo phương pháp Sanger cổ điển sử dụng đồng vị phóng xạ, người kỹ thuật viên cần thiết lập đồng thời bao nhiêu ống nghiệm phản ứng song song cho một mẫu xét nghiệm?

Câu 10. Trong kỹ thuật FISH chẩn đoán nhanh trước sinh, người ta sử dụng bộ probe kiểm tra 5 loại nhiễm sắc thể hay gặp bất thường lệch bội nhất ở người. Đó là NST 13, 18, 21 và hai nhiễm sắc thể nào nữa?

Câu 11. Quan sát tiêu bản Interphase FISH của một bệnh nhi nghi ngờ mắc hội chứng Down sử dụng probe đặc hiệu cho locus trên NST 21 gắn huỳnh quang màu đỏ. Đếm số lượng tín hiệu huỳnh quang màu đỏ xuất hiện bên trong nhân tế bào của bệnh nhi này, thu được bao nhiêu tín hiệu nếu bệnh nhi thực sự mắc hội chứng Down thể thuần?

Câu 12. Một người nam giới bình thường về số lượng nhiễm sắc thể ($46,\text{XY}$) khi làm xét nghiệm FISH trên tế bào kỳ trung gian với bộ probe đánh dấu đặc hiệu NST X (màu xanh lá) và NST Y (màu đỏ) sẽ quan sát thấy bao nhiêu chấm màu đỏ trong mỗi nhân tế bào?

Câu 13. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ nhiệt tiêu chuẩn bao gồm mấy bước biến đổi nhiệt độ kế tiếp nhau?

Câu 14. Để phân tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ chênh lệch nhau chỉ 1 nucleotide trong phương pháp giải trình tự Sanger, người ta sử dụng bản gel làm từ hợp chất polyme nào (viết tên loại gel)?

Câu 15. Khoảng kích thước nucleotide thông thường của các đoạn mồi oligonucleotide tổng hợp nhân tạo được dùng trong phản ứng PCR nằm trong khoảng từ bao nhiêu đến bao nhiêu nucleotide (ghi theo dạng: từ ... đến ... nucleotide)?

PHẦN IV. TỰ LUẬN (10 câu)

Câu 1 (1,0 điểm).
Trình bày nguyên tắc cơ bản và mục đích của 3 bước chính trong quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô/tế bào người. Giải thích rõ vai trò sinh hóa của hóa chất SDS và dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) trong quy trình này.

Câu 2 (1,0 điểm).
Nêu nguyên lý xác định nồng độ và đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD). Một mẫu DNA sau khi tách chiết có giá trị $\text{OD}_{260}/\text{OD}_{280} = 1{,}45$, kết quả này phản ánh điều gì về chất lượng mẫu và biện pháp xử lý để cải thiện độ tinh sạch là gì?

Câu 3 (1,0 điểm).
Trình bày nguyên tắc phân tách các phân tử nucleic acid trong kỹ thuật điện di gel agarose. Tại sao các phân tử DNA có kích thước khác nhau lại di chuyển với tốc độ khác nhau qua mạng lưới gel khi đặt trong điện trường? Phân tích nguy cơ độc hại của chất nhuộm Ethidium bromide (EtBr) và nêu các chất nhuộm thế hệ mới an toàn hơn.

Câu 4 (1,0 điểm).
Nêu thành phần đầy đủ của một hỗn hợp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) tiêu chuẩn. Phân tích chức năng sinh học của enzyme Taq DNA polymerase và giải thích tại sao enzyme này lại không có hoạt tính sửa sai ($3' \to 5'$ exonuclease). Trong trường hợp nào cần thay thế Taq polymerase bằng các dòng enzyme như Pfu polymerase?

Câu 5 (1,0 điểm).
Mô tả chi tiết 3 giai đoạn nhiệt độ trong một chu kỳ của phản ứng PCR (nhiệt độ cài đặt thông thường, hiện tượng phân tử xảy ra ở từng giai đoạn). Giải thích tại sao bắt đầu từ chu kỳ nhiệt thứ 3 thì phân tử DNA mang chiều dài chuẩn của đoạn mục tiêu mới xuất hiện.

Câu 6 (1,0 điểm).
Trình bày nguyên tắc giải trình tự DNA theo phương pháp kết thúc chuỗi của Frederick Sanger. Phân tích cấu trúc hóa học của phân tử Dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) và giải thích chính xác cơ chế vì sao sự gắn kết của ddNTP lại làm ngừng phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide.

Câu 7 (1,0 điểm).
So sánh sự giống và khác nhau giữa kỹ thuật khuếch đại gen bằng PCR và kỹ thuật giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger (về mục đích, số lượng mồi sử dụng, loại nucleotide cung cấp và sản phẩm tạo thành).

Câu 8 (1,0 điểm).
Trình bày nguyên tắc của phương pháp giải trình tự DNA tự động bằng hệ thống điện di mao quản có huỳnh quang. Làm thế nào máy giải trình tự có thể nhận biết và phân biệt chính xác 4 loại nucleotide (A, T, G, C) trong cùng một mao quản điện di duy nhất?

Câu 9 (1,0 điểm).
Trình bày nguyên lý cơ bản và quy trình 4 bước thực hiện kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH). So sánh ưu điểm, nhược điểm và phạm vi ứng dụng lâm sàng của kỹ thuật Metaphase FISH (trên nhiễm sắc thể kỳ giữa) và Interphase FISH (trên nhân tế bào kỳ trung gian).

Câu 10 (1,0 điểm).
Phân tích ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh các bất thường lệch bội số lượng nhiễm sắc thể và trong chẩn đoán gen ung thư. Nêu ý nghĩa của việc sử dụng các mẫu dò đa màu (probe đánh dấu các màu huỳnh quang khác nhau) trong việc phát hiện đồng thời các hội chứng Down (Trisomy 21) và hội chứng Patau (Trisomy 13).

--------- HẾT ---------

HƯỚNG DẪN CHẤM VÀ ĐÁP ÁN THAM KHẢO

A. ĐÁP ÁN PHẦN I (TRẮC NGHIỆM 4 LỰA CHỌN)

Mỗi câu đúng được 0,1 điểm. Tổng: 10,0 điểm.

B. ĐÁP ÁN PHẦN II (TRẮC NGHIỆM ĐÚNG/SAI)

Thang điểm: Đúng 1 ý = 0,1 điểm; Đúng 2 ý = 0,25 điểm; Đúng 3 ý = 0,5 điểm; Đúng cả 4 ý = 1,0 điểm.

C. ĐÁP ÁN PHẦN III (TRẢ LỜI NGẮN)

Mỗi câu trả lời đúng được 0,5 điểm.

D. ĐÁP ÁN VÀ THANG ĐIỂM PHẦN IV (TỰ LUẬN)